Praktikum Organische Chemie/ Chromatographie

Trennung der Farbstoffe aus den Kelchblättern von Hibiscus sabdariffa L, ("Malventee") durch absteigende Papierchromatographie

Getrocknete Blütenkelche von Hibiscus sabdariffa

Absteigende Entwicklung eines Papierchromatogramms, Beginn

Farbstoffe aus Hibiscus sabdariffa

Materialien

•  Malventee (1 Gramm pro Teilnehmer(in)
•  Butanol,  Eisessig,  Methanol, konz.  Salzsäure
• Chromatographiepapier ("mittelschnelle Laufeigenschaft") (z. B. Macherey und Nagel, Typ MN 261)

1. Vorbereitung der Trennkammer

(für 2 Personen) Im Scheidetrichter werden 100 ml n-Butanol, 25 ml Eisessig und 125 ml entmineralisiertes Wasser geschüttelt (Butanol-Eisessig-Wasser 4:1:5). Nach Trennung der beiden Phasen lässt man die Unterphase ab. Sie wird zur Kammersättigung verwendet, indem man die Trennkammer damit füllt und die Wandungen benetzt. Die Trennkammer wird mit Deckel versehen und mehrere Stunden zur Äquilibrierung sich selbst überlassen. Die Oberphase wird zum Entwickeln der Chromatogramme verwendet; mit ihr wird der Trog gefüllt.

2. Extraktion des Pflanzenmaterials

(für ganzen Praktikumskurs) Man bereitet eine Mischung von l ml konz. Salzsäure + 99 ml Methanol. In einem Erlenmeyerkolben werden 1.0 g des Pflanzenmaterials mit 10 ml der methanolischen Salzsäure übergossen und mindestens l h sich selbst überlassen.

3. Chromatographische Trennung

Auf sauberer Unterlage schneidet man sich mit der Schere eine Bahn Chromatographiepapier zurecht (17 × 55 cm). Das Papier soll nicht geknickt, zerknittert oder beschmutzt werden. Mit weichem Bleistift zieht man 10 cm vom kurzen Rand entfernt eine gerade Linie und markiert darauf die Startpunkte, die 2.5 cm vom langen Rand entfernt sein und untereinander einen Abstand von 3 cm haben sollen. Ein kleiner Teil des Extraktes wird in steigender Konzentration (Konzentrationsreihe) aufgetüpfelt. Vor der Wiederholung des Auftüpfelns mit Haartrockner trockenblasen. Das Papier wird in die Trennkammer eingehängt; die Startlinie muss horizontal sein. Man entwickelt über Nacht. Am nächsten Morgen nimmt man das Chromatogramm heraus, markiert mit Bleistift die Lösungsmittelfront und lässt das Papier an einer "Wäscheleine" im Abzug trocknen.

4. Auswertung

Umranden Sie nach dem Trocknen die Flecken, notieren Sie sofort die Farbe. Bestimmen Sie die Rf-Werte.

5. Hintergrund

Die Kelchblätter von Hibiscus sabdariffa L. enthalten mehrere Farbstoffe. Neben den Hauptkomponenten A und B wurden noch in kleineren Anteilen C und D sowie das Flavyliumsalz E nachgewiesen.

6. Fragen

In welche Naturstoffklassen kann man diese Farbstoffe einordnen? Welche Verbindungen erwarten Sie, wenn diese Farbstoffe mit verdünnten wässrigen Mineralsäuren behandelt werden? Formulieren Sie Reaktionsgleichungen! Wozu ist Säure notwendig?

Literatur

D. T. Du, F. J. Francis, Anthocyanins of Roselle (Hibiscus sabdariffa L., J. Food Science, 38, 810-812 (1973). Der Versuch wurde vom Autor des Wikibooks für das Organisch-chemische Praktikum ausgearbeitet.

Dünnschichtchromatographie von Azofarbstoffen an verschiedenen stationären Phasen

(Kieselgel, Aluminiumoxid, Reversed-Phase)

Materialien

Verschiedene DC-Folien oder -Platten (siehe oben)

 Azobenzol  p-Aminoazobenzol  p-Hydroxyazobenzol

Reine Lösungsmittel:  Toluol,  Petrolether,  Ethylacetat,  Methanol

Durchführung

Man bereitet Lösungen von Azobenzol, p-Aminoazobenzol und p-Hydroxyazobenzol in Toluol. Von den Lösungen wird auf folgende Trennschichten (stationäre Phasen) eine ausreichende Menge am Start aufgetüpfelt, so dass drei nebeneinanderliegende Startflecke vorliegen:

• a) Kieselgel
• b) Aluminiumoxid, basisch
• c) Reversed-Phase Kieselgel, z.B. RP-C12-SiO₂

Mit einem Bleistift markiert man die Startlinie. Als mobile Phase (Fließmittel) für Kieselgel und Aluminiumoxid wird Petrolether/Ethylacetat (4:1) verwendet. Die Reversed-Phase-Schicht entwickelt man mit Methanol-Wasser (3:1).

Auswertung

Bestimmen Sie die Rf -Werte und beachten Sie jedesmal die Reihenfolge der Retention der Azoverbindungen!

Erklärung für die Unterschiede?

Isolierung von Myristicin aus dem Muskatnuss-Extrakt durch präparative Schichtchromatographie (PSC)

Dieser Abschnitt ist noch im Entstehen und noch nicht offizieller Bestandteil des Buchs. Gib den Autoren Zeit, den Inhalt anzupassen!

Formel von Myristicin

Materialien und Anweisungen der GefStoffV

• Die ethanolische Mutterlauge der Kristallisation aus dem Versuch "Trimyristin".

•  Kaliumhydroxid

• tiefsiedender, trockener  Petrolether

• trockenes  Ethylacetat (Essigsäureethylester)

•  Dichlormethan (Methylenchlorid)

•  Magnesiumsulfat

• PSC-Fertigplatte (Kieselgel mit Fluoreszenzindikator 254 nm, 20 × 20 cm, Schichtdicke 2 mm)

Versuchsbeschreibung

Vorarbeit

Aus festem Kaliumhydroxid wird eine 50-prozentige wässrige Lösung (Kalilauge, mindestens 25 ml) bereitet. Vorsicht! Schutzbrille!

a) Aufarbeitung der Trimyristin-Mutterlauge

Zur Verseifung der restlichen Triglyceride wird die ethanolische Lösung in einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben mit 25 ml einer 50%igen wässrigen Kaliumhydroxid-Lösung versetzt. Die dunkelbraune Reaktionsmischung lässt man über Nacht stehen. Daraufhin wird die Lösung in einen l Liter-Scheidetrichter übergeführt, vorsichtig mit je 200 ml Wasser und tiefsiedendem Petrolether versetzt (nicht schütteln - Gefahr der Emulsionsbildung) und über Nacht sich selbst überlassen (Auffanggefäß unter den Scheidetrichter stellen, falls dieser undicht wird). Am nächsten Tag wird die organische Phase abgetrennt und mit Magnesiumsulfat mindestens l h getrocknet. Nach dem Abfiltrieren werden die Lösungsmittel im Rotationsverdarapfer abdestilliert. Das so erhaltene Substanzgemisch wird gewogen und durch Dünnschichtchromatographie untersucht; als Referenzsubstanz wird reines Myristicin (vom Assistenten erhältlich) aufgetüpfelt. Entwickelt wird mit dem Lösungsmittelgemisch Petrolether/Essigsäureethylester (4:1). Die Detektion der Substanzen erfolgt unter UV-Licht und durch Besprühen der Folie mit dem Anisaldehyd- oder Vanillin-Schwefelsäure-Reagens (zur Sichtbarmachung der Flecken muss die Folie eventuell kurz mit dem Fön erhitzt werden).

b) Isolierung von Myristicin durch präparative Schichtchromatographie

Das Substanzgemisch wird in l ml des für die Entwicklung der Dickschichtplatte benötigten Lösungsmittelgemisches (Petrolether/Essigsäureethylester (4:1) gelöst. Die PSC-Fertigplatte wird mit einem Bleistiftstrich 2 cm parallel zum unteren Rand und l cm von den beiden Seitenrändern entfernt markiert. Auf dieser Linie trägt man die Lösung mit einer ausgezogenen Pipette vorsichtig auf. Der obere Teil der PSC-Platte ist am besten mit einem Blatt Papier abgedeckt. Die Entwicklung der Platte findet in einer Kammer statt, die mit Filtrierpapier an den Seitenwänden zur Erzielung einer guten Kammersättigung ausgekleidet ist. Das Laufmittel (s.o.) soll in das Entwicklungsgefäß ca. l cm hoch eingefüllt sein. Es wird zweimal entwickelt. Vor der zweiten Entwicklung lässt man die Platte mit Hilfe eines Stickstoff-Stroms oder eines Föns kurz trocknen. Die Detektion der getrennten Substanzen findet unter der UV-Leuchte statt; die Zonen werden mit dünnen Bleistiftstrichen markiert. Zusätzlich können die Substanzen noch durch Ansprühen mit dem Anisaldehyd- oder Vanillin-Schwefelsäure-Reagens nachgewiesen werden. Hierzu wird die Platte bis auf einen Randstreifen von 1-2 cm mit einer Glasplatte oder einem starken Karton abgedeckt, der Rand mit dem Reagens besprüht und kurz mit dem Fön erhitzt. Die gewünschte Zone wird mit einem Spatel oder einem spitzen Messer herausgekratzt oder abgehoben (die besprühte Fläche wird ausgespart); dazu stellt man die Platte senkrecht auf ein Blatt Papier. Man zerkleinert die groben Kieselgel-Brocken auf dem Papier oder im Mörser und füllt dann das Pulver in einen Erlenmeyer-Kolben, wo es mit 40 ml Dichlormethan digeriert wird. Man filtriert vom Kieselgel ab und wäscht dreimal mit Dichlormethan nach. Das Filtrat wird in einem zuvor gewogenen Kolben im Rotationsverdampfer eingeengt, der Rückstand ausgewogen und im DC auf Reinheit geprüft, wobei man wieder reines Myristicin als Vergleichssubstanz verwendet. Die kleine Menge des extrahierten Myristicins kann in einem  Kugelrohrofen im Vakuum destilliert werden, falls dieses Gerät im Praktikum zur Verfügung steht.

Präparatives Schichtchromatogramm der Neutralfraktion des Muskatnuss-Extraktes.

Abb. #1. Präparatives Schichtchromatogramm der Neutralfraktion des Muskatnuss-Extraktes.

Hintergrund

Von den in der Muskatnuss enthaltenen Stoffen (siehe Versuch „Trimyristin“) wurden Fette und ätherische Öle aus den Gerüststoffen extrahiert, und ein Großteil des Triglycerids (Trimyristin) durch Kristallisation gewonnen. Die in der Mutterlauge noch enthaltenen Glyceride werden nun verseift und bleiben bei der Extraktion des ätherischen Öls in der wässrigen Phase (Salzbildung im basischen Milieu).

Für den typischen Geruch der geriebenen Muskatnuss sind die Komponenten des ätherischen Öls verantwortlich, welches durch verschiedene Methoden abgetrennt werden kann.

Die Analyse des ätherischen Öls, vor allem durch die Methode der Gaschromatographie, zeigte eine Fülle von Inhaltsstoffen an. Wie in den meisten ätherischen Ölen treten verschiedene Terpen-Kohlenwasserstoffe auf: p-Mentha-1,4-dien, p-Mentha-1,4(8)-dien, p-Mentha-1,8-dien (Limonen), p-Cymol, alpha- und beta-Pinen, Sabinen, Camphen (Formelschema 1, welche Konstitutionsformeln haben die nicht gezeigten Komponenten?)

Als weitere Terpene wurden Geraniol, Citronellol, Citronellal, Linalool, p-Menth-l-en-4-ol (4-Terpinol), p-Menth-l-en-8-ol, Cineol, Borneol, Campher und Cineol nachgewiesen (Formelschema 2, nicht angegebene Formeln nachtragen!). Typische Inhaltsstoffe des Muskatnusskerns, die auch für den Geruch bestimmend sind, gehören jedoch der Klasse der Phenylpropan-Derivate an (Formelschema 3); es handelt sich um Phenolether. Sie werden mit den Trivialnamen Eugenol (vgl. Nelkenöl), Isoeugenol, Methyleugenol, Methylisoeugenol, Safrol, Methoxyeugenol, Elemicin, Isoelemicin bezeichnet. Die Hauptkomponente des ätherischen Öls der Muskatnuss ist das Phenylpropanderivat Myristicin. Das ätherische Öl der Muskatnuss hat, in großen Mengen eingenommen, eine psychotrope (halluzinogene) und toxische Wirkung; diese scheint vor allem auf das Myristicin zurückzugehen.

Die komplexe Zusammensetzung des in unserem Versuch erhaltenen ätherischen Öls in dem Petrolether-Extrakt (Neutralfraktion) wird durch das Kapillargaschromatogramm in Abb. #2 dokumentiert. Durch die präparative Schichtchromatographie wird die Hauptkomponente des ätherischen Öls (Myristicin) in reiner Form erhalten, wie eine GC/MS-Analyse (Abb. #3) und ein ¹H-NMR-Spektrum (Abb. #4) beweisen.

[[Datei:]] Abb. #2. Kapillar-GC der Neutralfraktion des Muskatnuss-Extraktes.

[[Datei:]] Abb. #3. GC/CIMS-Analyse des aus der Neutralfraktion isolierten Myristicins.

[[Datei:]] Abb. #4. ¹H-NMR-Spektrum (60 MHz, CDCl₃) des aus der Neutralfraktion isolierten Myristicins.

Protokoll

Zeichnen Sie ein Fließschema, in dem die einzelnen Schritte der Auftrennung und Isolierung der Inhaltsstoffe der Muskatnuss angegeben werden.

Einzelnachweise

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Literatur

• Knaurs Pflanzenreich in Farben, Bd. l, S. 75, Droemer, Zürich 1964.
• E. Gildemeister und F. Hoffmann, Die ätherischen Öle (Hrsg. W. Treibs), 4. Aufl. Bd. 4, S. 666, Akademie-Verlag, Berlin 1956.
• D. A. Kalbhen: Die Muskatnuß als Rauschdroge, Angew. Chem. 83, 392 (1971).

Gaschromatoqraphische Untersuchung von Wasserdampfdestillaten aus Citrusfruchtschalen und Kümmel

Zu diesen Versuchen wurde ein Gaschromatograph (Doppelsäulengerät) mit gepackten Glassäulen (Länge 1,3 m, Durchmesser 5 mm) und Wärmeleitfähigkeitsdetektor (WLD) verwendet.

Säule 1: Packung mit 5% OV 101 auf Volaspher A2 100 - 120 mesh

Säule 2: Packung mit 5% Diethylenglykolsuccinat-polyester (DEGS) auf Chromosorb G-AW 100 -120 mesh

Ofentemperatur: 150 °C

Messstrom des WLD: 100 mA

Abschwächung: 32 Skalenteile

Aufgabe

Fertigen Sie zwei Gaschromatogramme an!

Injizieren Sie je etwa 1.5 Mikroliter der 5-prozentigen Hexan-Lösung aus den Versuchen "Ätherisches Öl aus Kümmel durch Wasserdampfdestillation" und "Ätherisches Öl aus Orangenschalen durch Wasserdampf-Destillation. Die jeweils fehlende Lösung aus diesen Versuchen lassen Sie sich von einem anderen Teilnehmer des Praktikums geben!

Auswertung

Notieren Sie alle wichtigen GC-Parameter (Säulenlänge, Natur der stationären Phasen und Träger, siehe oben; Ofentemperatur, Strömungsgeschwindigkeit in ml Helium/min; Papiervorschub des Schreibers in cm/min).

Zeichnen Sie in das Elutionsdiagramm (= Gaschromatogramm) als Abszisse eine Skala der Retentionszeit in Minuten ein (siehe Abbildung) und ermitteln Sie die korrigierten Retentionszeiten. Kleben Sie das Gaschromatogramm in Ihr Protokoll und geben Sie die GC-Parameter an.

GC eines Kümmel-Wasserdampfdestillats in Hexan

Abbildung: GC eines Kümmel-Wasserdampfdestillats in Hexan unter obigen Bedingungen (links Säule 1; rechts Säule 2). Das starke Signal Nr. 1 stammt vom Lösungsmittel.

Gaschromatoqraphische Identifizierung von Limonen und Carvon durch Koinjektion

Im Wasserdampfdestillat des Kümmels sind als Hauptprodukte der Terpenkohlenwasserstoff  Limonen und das Terpenketon  Carvon enthalten. Schätzen Sie ab, welche Verbindung von der verwendeten GC-Phase stärker zurückgehalten (retentiert) wird! Zum Beweis, welcher Peak im GC dem Limonen und welcher dem Carvon zukommt, wird die Analysenprobe nach Aufnahme des Gaschromatogramms (siehe oben) mit - möglichst derselben Menge - Limonen und/oder Carvon versetzt und erneut gaschromatographisch untersucht. Als Vergleichssubstanz Limonen kann das Orangenöl-Destillat aus Versuch ## verwendet werden oder die Hexan-Lösung des Citrus-Wasserdampfdestillats.

Eine Probe Carvon erhalten Sie von dem/der Betreuer/in.

Die Identifizierung der Komponenten ergibt sich daraus, dass der Peak der koinjizierten Substanz zunimmt. Die Peaks dürfen jedoch nicht über den oberen Rand des Schreibpapiers "hinausschießen", sonst würde man getrennte Spitzen sehr eng beieinanderliegender Peaks nicht erkennen.