Medizinische Mikrobiologie: Mikrobiologische Diagnostik

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Allgemeines

Je nach Fragestellung und Verdachtsdiagnose werden Blutkulturen, Urin, Stuhl, Liquor, Hautgeschabsel, Haare, Rachenabstrich, Wundabstrich, Sputum o.a. zur mikrobiologischen Untersuchung versandt. Bei der Probenentnahme und dem Versand müssen bestimmte Regeln beachtet werden. Damit der Mikrobiologe eher fündig wird sollten ein paar kurze klinische Angaben nicht fehlen.

Testverfahren Bakteriologie, Mykologie und Parasitologie

Mikroskopie

Lichtmikroskope bieten meist die Vergrößerung 40x, 100x und 400x. Diese ergibt sich als Produkt aus dem Vergrößerungsfaktor des Okulars (meist 10x) und des Objektivs (meist 4x, 10x und 40x). Mit speziellen 100x Objektiven ist zusammen mit der Verwendung von Immersionsöl eine 1000fache Vergrößerung möglich.

Bakterien werden üblicherweise in 400 bis 1000facher Vergrößerung angesehen.

Deckglaspräparat

Mit dem Deckglaspräparat können Mikroorganismen nativ, also in natura betrachtet werden.

Tuschepräparat

Cryptococcus neoformans, schwache Tusche-Färbung.

Das Tuschepräparat dient der Darstellung von Bakterienkapseln (z.B. Klebsiellen, Pneumokokken) oder Pilzkapseln (Cryptococcus sp). Die Kapsel färbt sich nicht an und bildet einen hellen Ring. Das Präparat kann auch hitzefixiert und mit Safranin gegengefärbt werden.

Mikroskopische Färbungen

Zur morphologischen Darstellung und Speziesdifferenzierung können verschiedene Färbungen durchgeführt werden.

Vorbehandlung: Mit einer in der Bunsenbrennerflamme sterilisierten Öse wird das Material auf den Objektträger aufgebracht und trocknen gelassen. Danach wird der Objektträger zur Hitzefixierung mehrmals mit der Probe nach oben durch die Flamme gezogen.

350

Gram-Färbung

Die Gram-Färbung ist eine Standardfärbung zur Beurteilung der Morphologie (Kokken, Stäbchen, Haufen, Ketten usw.) und des differentialdiagnostisch wichtigen Gram-Verhaltens.

Technik: Die Bakterien werden mit Kristallviolett für 30 Sekunden gefärbt und mit Lugolscher Lösung (Jod-Kalium-Lösung) für eine Minute gebeizt. In der bakteriellen Zellwand entsteht nun ein Jod-Farbstoff-Komplex ("Farblack"). Das vorsichtige, tropfenweise Entfärben (Differenzieren) mit Alkohol löst aus den dünnwandigen Gram-negativen Bakterien den Farbstoff viel stärker wieder heraus als aus der dicken Mureinhülle Gram-positiver Bakterien. Danach spült man gut mit Wasser, färbt mit Safranin (30 Sekunden) gegen, spült noch einmal und trocknet das Präparat.

Ergebnis: Gram-positive Bakterien erscheinen nach der Färbung blau-violett, Gram-negative rot-rosa.

Giemsa-Färbung

Mit der Giemsa-Färbung können u.a. Protozoen dargestellt werden. Das Färberesultat kann je nach verwendeten Reagenzien, Färbedauer und Fixierungstechnik unterschiedlich ausfallen.

Neisser-Färbung

Die Neisser-Färbung ist eine Standardfärbung zur Beurteilung von Corynebakterien, z.B. dem Corynebacterium diphtheriae.

Technik: Das Präparat wird 1 Minute mit Neisser I (Methylenblau, Kristallviolett, Ethanol) behandelt, die Farbe abgegossen (nicht gespült) und dann mit Neisser II (Chrysoidin- oder Bismarkbraunlösung) für 1 Minute gefärbt, die Farbe abgegossen (nicht gespült) und das Präparat zwischen Filterpapier getrocknet.

Ergebnis: Die meist terminal angeordneten aus Calcium und Polyphosphaten bestehenden metachromatischen Polkörperchen färben sich schwarz-blau und heben sich vom gelb-braun gefärbten Rest der Bakterienzelle ab.

Kinyoun-Färbung

Die Kinyoun-Färbung ist eine Standardfärbung zur Identifizierung von säurefesten Bakterien, die z.B. bei Befall mit Mycobacterium tuberculosis auftreten. Die Säurefestigkeit kommt durch einen hohen Anteil von sauren Lipiden und Wachsen in der Zellwand zustande.

Technik: Die hitzefixierten Präparate werden 2 Minuten mit Karbolfuchsin behandelt, gespült, mit Salzsäurealkohol entfärbt und nochmals gespült. Danach erfolgt die Gegenfärbung mit Methylenblau für 20-30 Sekunden. Das Präparat wird wieder mit Wasser gespült und zwischen Filterpapier getrocknet.

Ergebnis: Säurefeste Stäbchen heben sich leuchtend rot vom blauen Hintergrund ab.

Ziehl-Neelsen-Färbung

Tbc-Bakterien in der Ziehl-Neelsen-Färbung.

Wie mit der Kinyoun-Färbung können auch mit der Ziehl-Neelsen-Färbung säurefeste Bakterien dargestellt werden.

Sporenfärbung nach Schaeffer-Fulton

Mit der Sporenfärbung nach Schaeffer-Fulton werden Sporen dargestellt. Bakterien und Sporen werden aggressiv gefärbt und die vegetativen Formen entfärbt. Der Kontrast wird durch Gegenfärbung mit Safranin erhöht.

Technik: Das Präparat wird für 2 Minuten in heißer Malachitgrün-Lösung gefärbt, danach gründlich mit Wasser gespült und mit Safranin für 1 Minute gegengefärbt. Das Präparat wird dann zwischen Filterpapier getrocknet.

Kapselfärbung nach MANEVAL

Durchführung: Kongorot und Bakterien mischen, Ausstrich herstellen, lufttrocknen, abspülen mit MANEVAL`scher Lösung und 5-6 min einwirken lassen, vorsichtig mit Aqua dest. abspülen.

Prinzip: MANEVAL`scher Lösung (enthält Fuchsin, das färbt die Bakterien; FeCl₃ und Phenol zur Festigung der Kapsel; Essigsäure oder verdünnte HCl zur Senkung des pH-Wertes). Kongorot ist der pH-Wert-Indikator und färbt sich bei saurem blau.

Ergebnis: Hintergrund blau, Kapsel weiß, Bakterien rot.

Kultur

Ziele der Kultur sind die Spezieseinordnung und die Gewinnung von Reinkulturen für weitere Untersuchungen.

Kulturformen

Primärkulturmedien dienen der Erstkultur aus dem Untersuchungsmaterial.

Anreicherungsmedien sind optimal auf das Wachstum einer bestimmten Keimart abgestimmt, um diese zu vermehren.

Spezialnährmedien dienen dem Anzüchten von Keimen, die auf bestimmte Wachstumsbedingungen angewiesen sind.

Selektivnährmedien enthalten zusätzlich Stoffe, die unerwünschten Begleitkeime hemmen und/oder das Wachstum des gesuchten Keims fördern.

Indikatormedien dienen zum Anzüchten einer Keimart mit gleichzeitiger Prüfung ihrer biochemischen Leistungen.

Anlegen und Bebrüten einer Kultur

3-Ösen-Ausstrich

Um Bakterien zu isolieren werden diese auf Agar mit dem 3-Ösenausstrich vereinzelt und das Wachstum der colony forming units (CFU) abgewartet. Technik: Mit der ausgeglühten und abgekühlten Öse wird etwas Material von der Probe entnommen und im Zick-Zack vom Rand zur Mitte auf einem Drittel der Agar-Oberfläche verteilt. Die Öse wird wieder ausgeglüht und nach Abkühlen zieht man sie einmal durch das bereits beimpfte Feld und dann im Zick-Zack über das zweite Drittel des Nährbodens. Nach Ausglühen wird in analoger Weise das letzte Drittel beimpft, nachdem man die Impföse einmal durch das zweite Drittel gezogen hat.

Im Gegensatz dazu wird beim konfluenten Ausstrich der gesamte Agar gleichmäßig beimpft.

Kulturbedingungen

Bakterien haben unterschiedliche Ansprüche. Wichtige Faktoren sind die Temperatur, der O₂ und CO₂-Gehalt der Luft und die Beschaffenheit des Nährmediums (Glucose-, NaCl-, Blut-, Serum-, Fleischextraktgehalt). Einige Bakterien benötigen zur Pigmentbildung Licht.

Kultur auf Agar

Kriterien zur Beurteilung der Kolonien auf festen Nährmedien sind die Größe und Oberfläche der Kultur, das Hämolyseverhalten, die Farbstoffbildung und Farbveränderungen bei Indikatorzusatz.

Blut-Agar

Hämolyse-Verhalten von Streptokokken: α-Hämolyse bei S. mitis (links), β-Hämolyse bei S. pyogenes (Mitte) und γ-Hämolyse bei S. salivarius (rechts).

Beurteilen lassen sich hier die Morphologie der Kolonien und das Hämolyse-Verhalten.

• α-Hämolyse - Unvollständige Hämolyse: Um die Kolonien finden sich im Hämolysehof mehr oder weniger farbige Zwischenprodukte des Hämabbaus.
• β-Hämolyse - Vollständige Hämolyse: Um die Kolonien befindet sich ein farbloser Hof, das Häm ist vollständig abgebaut.
• γ-Hämolyse - keine Hämolyse
• Doppel-Hämolyse - Zwei im Agar verschieden schnell wanderende hämolytische Toxine führen zu Doppelringen (bei Clostridium perfringens).

MacConkey-Agar

Der MacConkey-Agar ist ein Selektivnährboden für gramnegative Stäbchen.

Leifson-Agar

Der Desoxycholat-Citrat-Agar nach Leifson dient zur Differenzierung coliformer Keime, da es sich um einen Selektivnährboden bzw. Differenzialnährboden handelt. Er wird vor allem für die Diagnostizierung der Gattungen Salmonella und Shigella genutzt.

Tinsdale-Agar (Natriumtellurit-Agar)

Auf diesem Indikatormedium bilden Corynebakterien schwarze Kolonien durch Reduktion des metallischen Tellur. In höheren Konzentrationen unterdrückt Tellurit auch das Wachstum anderer Bakterien der Rachenflora. Weitere Bakterien die Tellurit reduzieren können sind verschiedene Staphylokokken, Streptokokken, nicht-pathogene Corynebakterien und Hefen.

Kochblut-Agar

Haemophilus influenzae ist auf Hämin und NADP angewiesen und wächst daher nicht auf normalem Blutagar, aber auf Kochblut. Auf normalem Blutagar wächst er dann, wenn man ihn gleichzeitig mit Staphylococcus aureus bebrütet ("S. aureus-Amme").

Thayer-Martin-Agar

Dient zur Anzucht von Neisserien.

Sabouraud-Agar

Medium zur Anzucht von u.a. Candida albicans.

Citrat-Röhrchen

Indikatormedium zur Prüfung der Citratverwertung

Technik: Mit einer Impfnadel wird die Schrägfläche mit der verdächtigen Kultur bestrichen. Der Nährboden enthält Bromthymolblau als ph-Indikator, dieser schlägt bei Citratverwertung von grün (sauer) nach blau (alkalisch) um.

MIOH-Röhrchen

Mit dem MIOH-Röhrchen (Indikatormedium) werden 4 Reaktionen gleichzeitig überprüft:

• Motilität - Überprüfung der Ausbreitung im Nährboden.
• Indolreagenz – Prüfung, ob das Bakterium Tryptophan zu Indol abbauen kann. Positiv, wenn nach Zugabe des Kovacs- oder Ehrlich-Reagenz (Dimethylaminobenzaldehyd) innerhalb von 2 min. ein roter Farbstoff entsteht.
• Ornithinspaltung - Prüfung auf Ornithindecarboxylase-Aktivität. Positiv: blau, negativ: gelb.
• H₂S-Bildung - H₂S-Bildung führt zur Schwarzfärbung.

Anwendung: Differenzierung von Enterobakterien

Technik: Mit einer Impfnadel wird bis zum Boden in das Medium eingestochen.

Auswertung: MIOH + Citrat, Bsp.:

Enterobacterium	M	I	O	H	Citrat
Citrobacter freundii	+	-	+	+	+
Enterobacter aerogenes	+	-	+	-	+
Enterobacter cloacae	+	-	+	-	+
Escherichia coli	+	+	+	-	-
Klebsiella pneumoniae	-	-	-	-	+
Proteus mirabilis	+	-	+	+	+/-
Salmonella Typhimurium	+	-	+	+	+
Shigella sonnei	-	-	+	-	-

Quellen: Microbiology and Bacteriology - The world of microbes - Key for Enteric Unknowns

Indikator-Zusätze

Neutralrot zeigt bei Farbumschlag zu Rot Laktoseverstoffwechselung an. Laktose wird z.B. von Escherichia coli, Klebsiella und Enterobacter verstoffwechselt, nicht aber von Proteus, Salmonella und Shigella.

Flüssignährmedien

Kriterien zur Beurteilung: Trübung, Flockung, Bodensatz, Oberflächenhäutchen, Farbstoffbildung.

Tryptic soy bouillon (TSB)

Tryptic soy bouillon (tryptisch verdaute Sojabohnen-Bouillon) ist ein Flüssignährmedium zur Kultur aerober Bakterien.

Brewer-Thioglykolat-Bouillon

Der Brewer-Thioglykolat-Bouillon erzeugt ein aneraobes Mileu (SH-Gruppen, Vitamin K) und einen Redoxindikator und dient damit zur Identifizierung anaerober Bakterien.

Biochemische Methoden

z.T. bei Nährböden schon behandelt (MIOH, Citrat, Neutralrot)

Oxidase-Test

Nachweis der Cytochrom c Oxidase.

Technik: Di- bzw. Tetramethyl-p-phenyldiamin reduziert über Cytochrom c die Cytochrom c Oxidase, und wird dabei oxidiert zu einem roten bzw. blauen Farbstoff. Reduziertes Dimethyl-p-phenyldiamin reagiert mit 1-Naphthol zu Indophenolblau. Man gibt einen Tropfen Oxidase-Reagenz auf ein Stück Filterpapier und verreibt darin mit der einer nicht-metallischen Impföse etwas von der Bakterienmasse. Eine positive Reaktion ist an der sofortigen Blaufärbung zu erkennen.

Katalase-Test

Technik: Man entnimmt mit der Öse ein Stückchen einer Kolonie und hält sie in einen Tropfen H₂O₂. Durch die Katalase freiwerdender O₂ (2 H₂O₂ <-> 2 H₂O + O₂↑) führt zum Sprudeln. Katalase-positiv sind z.B. Staphylokokken, Katalase-negativ sind z.B. Streptokokken.

Koagulase-Test

Mit dem Koagulase-Test lässt sich die gebundenen Koagulase (clumping factor) von Staphylococcus aureus nachweisen und diesen Erreger damit gegen die Gruppe der Koagulase-negativen Staphylokokken (CONS) abgrenzen. Die Koagulase wandelt zusammen mit Thrombin Fibrinogen in Fibrin um.

Technik: Man suspendiert mehrere Kolonien in physiologischer NaCl-Lösung, so dass keine Klumpen mehr vorhanden sind. Dann gibt man Kaninchenplasma hinzu und schwenkt den Objektträger etwas. Bei Staphylococcus aureus kommt es binnen weniger Sekunden zur Koagulation (Klümpchenbildung, Flockung).

Durchführung als Deckglastest

Das zu untersuchende Material (eine Kolonie genügt) wird mit fibrinogenhaltigem Plasma verrieben. Sollte es sich bei der Probe um Staphylococcus aureus handeln, ist Clumping-Faktor A enthalten und die Probe flockt aus (Clumpingfaktor-positiv). Die Reaktion verläuft innerhalb von 1-2 Minuten und ist makroskopisch sichtbar.

Ist die Probe jedoch negativ, so handelt es sich (wahrscheinlich) nicht um Staphylococcus aureus, die Probe wird dann milchig-trübe. Bei MRSA (Methicillin resistenter Staphylococcus aureus) kann der Clumping-Faktor maskiert sein, so dass es zu einem falsch negativen Nachweis kommen kann.

Die Kolonie sollte jedoch vor Zugabe des Plasmas in 0,9% NaCl Lösung verrieben werden, da ein direktes Vermischen von Kolonie und Plasma bei Mikrokokken falsch positive Ergebnisse liefern kann.

Durchführung als Röhrchentest

Die zu prüfende Kolonie wird in sterilem NaCl auf Mc Farland 1 eingestellt. 50 µl dieser Suspension (entspricht ungefähr 3 Tropfen mit der sterilen Pasteurpipette) wird in einem Röhrchen mit 0,5 ml Kaninchenzitratplasma gemischt.

Kontrollen

• Positivkontrolle mit Staph. aureus ATCC
• Negativkontrolle mit Staph. epidermidis

Inkubation

• 18–24 h bei 37 °C im Wasserbad

Auswertung

Nach 4 Stunden und nach 18–24 Stunden. Grund dafür ist eine mögliche Bildung von Fibrinolysin welche nach 24 Stunden ein falsches Negativergebnis liefern kann.

• negativ: keine Koagulase
• 1+ positiv: kleine , nicht zusammenhängende Klümpchen
• 2+ positiv: kleine , zusammenhängende Klümpchen
• 3+ positiv: großer Klumpen
• 4+ positiv: Der gesamte Röhreninhalt ist koaguliert und das Röhrchen kann auf den Kopf gestellt werden ohne das der Inhalt herausläuft.

Bacitracin-Test

Mit dem Bacitracin-Antibiotikum-Testplättchen lassen sich beta-hämolysierende Streptokokken näher differenzieren. Man legt das Testplättchen auf einen frischen konfluenten Ausstrich und drückt es leicht mit der Pinzette an. Streptococcus pyogenes ist gegenüber Bacitracin empfindlich und es bildet sich ein Hemmhof um das Plättchen aus.

Optochin-Test

Optochin ist ein Chiniderivat (kein Antibiotikum) aus der Rinde des Chinabaums und hemmt das Wachstum von Streptococcus pneumoniae (Testblättchen), so dass sich dieser Keim aus der Gruppe der α-hämolysierenden Streptokokken (Gram-positiv, Kettenbildend, α-hämolysierend, aerob, Katalase-negativ) identifizieren lässt.

Biochemische Test-Systeme

Ein API®-System zur Durchführung einer „bunten Reihe“.

Ein System von Enterotube®.

Mit speziellen Testkits z.B. dem API®-System der Firma bioMérieux können dutzende verschiedener biochemischer Testreaktionen („biochemische bunte Reihe“) gleichzeitig und automatisiert durchgeführt werden, was das Verfahren für die Routinediagnostik prädestiniert.

Immunologischer Nachweis

Objektträger-Probeagglutination mit Antikörpern

Bei Verdacht auf pathogene Darmkeime (z.B. Salmonellen, enteropathogene E. coli) kann ein immunologischer Schnelltest eingesetzt werden.

Technik: Eine verdächtige Kolonie wird auf einem Objektträger mit dem jeweiligen anti-Verdachtserreger-Serum (z.B. anti-O-EPEC oder anti-O-Salmonella) vermischt, bis keine Klümpchen mehr sichtbar sind. Unter beständigem Schwenken kommt es bei positivem Ergebnis nach 30 bis 60 Sekunden zur Agglutination.

Wegen der mangelnden Genauigkeit muß eine nachträgliche biochemische Bestimmung allerdings trotzdem erfolgen.

Resistenztestungen

Indikationen für Resistenztestungen sind alle schweren Infektionen (Sepsis, Meningitis, Osteomyelitis, Endokarditis usw.), nosokomiale Infektionen, chronische Infektionen, Infektionen bei Immunsupprimierten und Therapieversager.

Neben dem therapeutischen Impact ergeben sich in der Gesamtschau vieler Resistenztestungen auch Rückschlüsse über die Resistenzlage in den Krankenhäusern und deren Fachabteilungen, so dass auch Patienten, bei denen die Testung noch aussteht, von einer besseren kalkulierten Therapie profitieren können.

Verdünnungs(Dilutions)-Methoden

Antibiotika werden in einer Verdünnungsreihe in flüssigen oder festen Nährmedien verdünnt (z.B. 128μg/ml, 64μg/ml, 32μg/ml,...), jeweils mit einer definierten Bakterienverdünnung beimpft und 18 Stunden bebrütet. Die Antibiotikakonzentration, bei der gerade noch kein Bakterienwachstum stattfindet, ist die minimale Hemmstoffkonzentration (MHK).

Zusätzlich kann man in den Proben, in denen kein Wachstum erfolgt ist, die Keimdichte bestimmen und mit der Ausgangsverdünnung vergleichen. Die Verdünnungsstufe, bei der 99,9% des Inokulums abgetötet wurden, ist die minimale bakterizide Konzentration (MBK).

Agardiffusionsmethoden

Agardiffusionstest

Ein festes Nährmedium wird mit einer Standard-Verdünnung an Testbakterien gleichmäßig beimpft und standardisierte Antibiotikum-Testplättchen aufgelegt, aus denen das Antibiotikum herausdiffundiert. Die Konzentration im Agar nimmt mit der Entfernung vom Testplättchen zunehmend ab. Nach 18 Stunden Bebrütung kann anhand der Größe des Hemmhofes (in mm) die Sensibilität bestimmt werden.

E-Test

Beim E-Test wird ein mit einem Antibiotikumkonzentrationsgradienten imprägnierter Teststreifen auf den beimpften Agar aufgelegt. Die MHK kann an der Stelle abgelesen werden, an der die Bakterien bis an den Teststreifen heranwachsen.

Bewertung

Alle Tests haben Vor- und Nachteile, diese nun im Überblick:

	Dilution	Agardiffusion	E-Test
MHK-Bestimmung	präzise	ungenau	präzise
Unbeeinflusst vom Nährmedium	ja	nein	nein
Unbeeinflusst von der Diffusionsrate des AB	ja	nein	(ja)
Testung von Bakterien möglich, die Blut benötigen?	nein	ja	ja
Zur Notfalltestung geeignet?	nein	ja	unüblich
Teuer, aufwendig?	ja	nein	ja

Hemmstofftest

Der Hemmstofftest dient zum Aufspüren antimikrobieller Substanzen im Untersuchungsmaterial (z.B. bei antibiotisch anbehandelten Infektionen), da diese zu verminderten Keimzahlen führen und die Ergebnisse verfälschen können. Dafür wird ein hochempfindlicher Laborkeim (z.B. Bacillus subtilis) in Anwesenheit von Untersuchungmaterial bebrütet. Ein Hemmhof ist dementsprechend ein positiver Nachweis.

Serologie

Die Infektionssserologie beschäftigt sich mit dem Nachweis von erregerspezifischen Antigenen (siehe Testverfahren Virologie) und Antikörpern in Serum, Liquor und Punktaten.

Antikörpernachweis: Antikörper bilden sich nach Antigenkontakt, IgM-Antikörper etwa 7 Tage nach der Infektion, IgA- und IgG etwas später. Während IgA und IgM nach einigen Wochen bis Monaten verschwinden, bleiben IgG-Antikörper Monate, Jahre und z.T. bis ans Lebensende nachweisbar (Seronarbe).

Die Bestimmung von Antikörpern wird eingesetzt bei Erregern, die schwer oder nicht anzüchtbar sind (Treponema pallidum, Toxoplasma gondii, Hepatitis-Viren), bei Postinfektionssyndromen ohne Erreger (Streptococcus pyogenes, Yersinien), bei epidemiologischen Fragestellungen (Herpes-Viren) und zur Kontrolle des Immunstatus (z.B. vor und nach einer Impfung).

Die Höhe des Antikörperspiegels wird in Titern oder Internationalen Einheiten (I.E.) angegeben. Der Titer wird bestimmt, indem vom Serum eine Verdünnungsreihe angelegt wird und diese getestet wird. Die niedrigste Konzentration mit noch positiver Reaktion ist dann der Titer, z.B. 1:16, 1:32 oder 1:64.

Agglutinationsmethoden

Messparameter ist die Agglutination durch Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen.

Hinweis: In den folgenden Abschnitten werden diese Begriffe und Zeichen synonym für Antikörper (Immunglobuline) benutzt: Ak, Ig, anti-X; bildhaft: Y, >-, -<

TPPA-Test

Treponema pallidum-Partikelagglutinationstest, NS - nicht sensibilisierte Erythrozyten, S - sensibilisierte Erythrozyten

Treponema pallidum-Partikelagglutinationstest

Bei diesem Syphilis-Screeningtest, der frische und ältere Infektionen nachweist werden biologisch inerte Gelatinepartikel (G) eingesetzt, die mit Antigen (Ag) von Treponema pallidum Nichols-Stamm beladen wurden. Werden sie mit positivem Patientenserum (d.h. Serum mit Antikörpern S-Ig gegen T. pallidum) inkubiert kommt es zur Agglutination.

Ag|G|Ag  >-  Ag|G|Ag   ->  Ag|G|Ag Ag|G|Ag Ag|G|Ag ...   (Agglutination über Fab des Ig)
                                  Y       Y       Y
      
        S-Ig                     S-Ig    S-Ig     S-Ig 

Die Sensitivität liegt bei 99,9%, die Spezifität bei 99-100%. 1% der Gesunden werden meist transient falsch positiv getestet, der Test ist allerdings hochspezifisch, wenn er mit einem weiteren Test (VDRL oder FTA-abs-Test) kombiniert wird.

Die Syphilis-Diagnostik folgt diesem Schema:

1. Suchreaktion: TPPA
2. Bestätigung: FTA-abs-Test
3. Verlaufskontrolle: VDRL-Test oder Cardiolipin-KBR (Komplementbindungsreaktion) und IgM-FTA-abs-Test zur Beurteilung der Aktivität und des Therapieerfolges.

VDRL-Test

Veneral-Disease-Research-Laboratories-Test

Bei der Syphilis (und vielen anderen Erkrankungen, die mit Gewebsschäden einhergehen) treten Autoantikörper gegen das mitochondriale Cardiolipin (Cl) auf. Diese können in einer Agglutinationsreaktion nachgewiesen und zur Verlaufskontrollle genutzt werden. Der VDRL-Test ist nicht spezifisch gegen T. pallidum gerichtet.

Cl  >-  Cl   ->  Cl Cl Cl ...     (Agglutination über Fab des Auto-Ig)
                   Y  Y  Y     
  S-anti-
  Cl-Ig 

Daneben gibt es noch den Cardiolipin-Mikroflockungstest (CMT), der nur im akuten Stadium der Lues positiv reagiert und deswegen Auskunft über die Therapiebedürftigkeit gibt.

Immunfluoreszenz

Beim indirekten Fluoreszenztest wird das Antigen (Ag) auf den Objektträger gebracht und fixiert. Danach wird das Patientenserum aufgebracht und inkubiert. Enthält das Serum Antikörper (S-Ig), so binden diese an das Antigen und können dann mit einem Fluoreszenzmarkierten Anti-Humanimmunglobulin (anti-hIg-F) markiert und im Fluoreszenzmikroskop gesehen werden.

|Ag     >-       >-F
           
       S-Ig     anti-hIg-F

FTA-abs-Test

Fluorescent Treponemal Antibody - Absorption - Test

Der FTA-abs-Test wird zur Bestätigung positiver TPPA-Test-Ergebnisse benutzt. Das Patientenserum wird zur Beseitigung kreuzreagierender Antikörper mit T. phagedensis-Ultraschallhomogenat vorinkubiert und dann auf mit T. pallidum-Antigen imprägnierte Objekträger aufgebracht. Die Detektion erfolgt mit FITC-Anti-Humanglobulin (FITC: Fluoreszein-Isothiocyanat).

Beim IgM-FTA-abs-Test wird vor der Testung das IgG aus dem Patientenserum abgetrennt und zur Detektion ein μ-Ketten-spezifisches Anti-Humanglobulin eingesetzt.

Bakterien-Systematik

Eine Übersicht über die medizinische Bakterien-Systematik auf der Grundlage der vorgenannten Differenzierungsmethoden finden Sie zu Anfang des Kapitels Spezielle Bakteriologie.

Testverfahren Virologie

Elektronenmikroskopie

Darstellung von Herpes simplex-Virionen im TEM.

Viren, die in hoher Zahl im Patientenmaterial vorhanden sind können nach Fixierung und Kontrastierung im Elektronenmikroskop betrachtet werden. Die Identifizierung erfordert lange Berufserfahrung. Ein Elektronenmikroskop verursacht hohe Anschaffungs- (200.000 bis 500.0000 €) und Betriebskosten. Für den Routinebetrieb daher nur bedingt geeignet. Von der Technik her können Transmissions- (TEM) und Rasterelektronenelektronenmikroskopie (REM), engl. scanning electron micrography (SEM) unterschieden werden. Ersteres mißt Elektronen, die durch dünne Objektschichten hindurchgeschossen werden, letzteres mißt die am Objekt reflektierten Elektronen.

Weblink:  Elektronenmikroskopie

Virusisolierung

Die Virusisolierung ist immer dann angebracht, wenn im Patientenmaterial sehr wenig virales Antigen nachweisbar ist. Zu diesem Zweck wird das Patientenmaterial auf Monolayer- oder in Suspensionszellkulturen gegeben. Falls eine Infektion erfolgt, kann bei einigen Viren eine Veränderung der Zellmorphologie, der zytopathische Effekt (CPE) beobachtet werden. Einen CPE verursachen z.B. Herpes Simplex-, Varicella-, Influenza-, Adeno-, Picorna-, Enteroviren, sowie Masern-, Mumps- und Rötelnviren. Einige andere Viren verursachen keinen CPE oder es existieren keine Zellen, die in vitro von diesen Viren infiziert werden.

Da im Patientenmaterial toxische Substanzen vorkommen können, die evtl. einen CPE vortäuschen, wird bei Nachweis eines CPE mit dem Überstand der Primärkultur eine Sekundärkultur angelegt. Die Zellen, die einen CPE zeigen oder der Kulturmedienüberstand dieser Zellen kann dann für weitere diagnostische Untersuchungen verwendet werden (siehe IFT, Ag-Nachweis in Zellen, Elektronenmikroskopie).

Viren quantifizieren

Anwendung: In der experimentellen Virologie, zur Aktivitätsprüfung von antiviralen Medikamenten, zur Konzentrationsseinstellung von Lebendimpfstoffen, vor der Virustypisierung im Neutralisationstest.

Endpunkttitration (Virus-Titer-Bestimmung)

Um die Virusmenge einer Lösung (Patientenmaterial, Viruskultur) grob abzuschätzen kann man von der Virussuspension eine geometrische Verdünnungsreihe anfertigen (1:10, 1:100, 1:1.000 usw.).Eine Multikulturplatte, deren Vertiefungen mit Zellen bewachsen sind, wird mit je einem Milliliter dieser Verdünnungen beimpft. Die Verdünnung, bei der nur noch 50% der Zellen einen CPE, d.h. Infektionszeichen zeigen, ist dann der Titer bzw. der TCID_50/ml (TCID: tissue culture infective dose).

Plaque-Test

Plaque-Test mit einer Verdünnungsserie.

Mit dem Plaque-Test lässt sich die mit dem Neutralisationstest bestimmte Virusmenge weiter spezifizieren. Hierzu werden (meist) einige Petrischalen mit einer definierten Menge an Virussuspension (Verdünnungsreihe um den TCID_50/ml-Wert herum) beimpft. Die Kulturen werden eine Stunde bei 37°C inkubiert, damit die Viren adhärieren können. Danach wird die Kultur mit einem Kristallviolett-haltigen Agar überschichtet, der den Viren nur noch die Ausbreitung von Zelle zu Zelle gestattet. Der enthaltene Vitalfarbstoff wird von lebenden, aber nicht von toten Zellen aufgenommen und gespeichert, so dass sich die infizierten Zellareale als helle Flächen vom blauen Zellrasen abheben.

Nach Kultur bei 37°C über 2- 7 Tage kann die Zahl der vermehrungsfähigen Viren als plaque forming units (PFU) angegeben werden bezogen auf die verwendete Verdünnung. Beispielweise bedeuten 15 PFUs bei der Verwendung von 1ml einer Serumverdünnung von 1:1.000 dann 15.000 PFUs pro ml Patienten-Serum.

Virus-Typisierung

Neutralisationstest (NT)

Hat man einen konkreten Anfangsverdacht so kann man mit dem Neutralisationstest den Erreger (Ag) bestimmen. Eine mittels Endpunkttritration definierte Virussuspension (1000 TCID_50/ml) wird mit verschiedenen Antiseren (anti-X-Ig) gemischt und eine Stunde bei 37°C inkubiert. Passen Virus und Serum-Antikörper zusammen so ist die Infektiösität aufgehoben und das Virus löst in der folgenden Kultur keinen CPE mehr aus.

Ag3   >-          -> keine Inaktivierung -> CPE
     anti-1-Ig
              
Ag3   >-          -> keine Inaktivierung -> CPE
     anti-2-Ig 
               
Ag3   >-          ->    -< Ag3 >-    Inaktivierung -> kein CPE
     anti-3-Ig               

Serologischer NT

In Umkehrung des vorbeschriebenen NT können mit Hilfe bekannter Virusstämme Antikörper im Patientenserum nachgewiesen werden und zusätzlich deren Titer bestimmt werden. Hierzu wird 1000 TCID_50/ml-Testvirussuspension mit den gleichen Volumina verschiedener Patientenserum-Verdünnungen (z.B. 1:4, 1:8, 1:16, ... ,1:128) 1 Stunde bei 37°C inkubiert und die verbliebene, d.h. nicht neutralisierte Infektionsfähigkeit in der Zellkultur (Mikrotiterplatte) getestet: Endpunkt-Titration der Antikörper.

1) Bestimmung des Antikörpers:

Ag1   >-          -> keine Inaktivierung -> CPE
     anti-3-Ig
              
Ag2   >-          -> keine Inaktivierung -> CPE
     anti-3-Ig 
             
Ag3   >-          ->    -< Ag3 >-    Inaktivierung -> kein CPE
     anti-3-Ig  

2) Titerbestimmung:

Ag3 + anti-3-Ig (Patientenserum in verschiedenen Verdünnungen) -> CPE/50%CPE/kein CPE  

ELISA

Der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ist der Test, der für fast alle viralen Erreger angewendet wird. Durch den Einsatz von Teil- oder Vollautomaten, die die Teste bearbeiten, ist der ELISA am wirtschaftlichsten und daher weit verbreitet.

Der Test beruht auf Antigen-Antikörper-Interaktionen, die mittels Farbreaktionen nachgewiesen werden.

Serologischer ELISA

Ziel: Nachweis von Virusspezifischen Antikörpern im Patientenserum

Methode: Eine mit Virus-Antigen (Ag) beschichtete Oberfläche wird mit dem Patientenserum inkubiert, nicht gebundene Antikörper (>-) werden durch Spülen entfernt. Haben Serum-Antikörper des Patienten (S-Ak) an das Antigen gebunden, dann können diese im zweiten Schritt mit einem kettenspezifischen anti-Antikörper gegen humanes Immunglobulin G (anti-hIgG) markiert werden, der mit einem Enzym (E), z.B. Meerrettichperoxidase (HRP) oder Alkalische Phosphatase (AP) gekoppelt ist (>-E). Nach Entfernung von nicht gebundenem anti-hIg, wird im dritten Schritt ein Chromogen (Farbreagenz) zugegeben, das vom Enzym in ein farbiges Produkt (FR) umgesetzt wird.

Reaktion wenn S-Ak vorhanden:

|Ag   >-     >-E       +|<-Chromogen
|Ag   >-     >-E       +|
|Ag   >-     >-E       +|-> farbiges Reaktionsprodukt (FR) 
                        
     S-IgG  anti-hIgG,Enzymgekoppelt  

Durch die Verwendung geometrischer Verdünnungen des Patientenserums kann der Antikörper-Titer bestimmt werden.

Neben dem IgG kann auch IgM bestimmt werden. Hierzu wird ein μ-Kettenspezifisches anti-hIg benutzt. Im Serum evtl. vorhandene Rheumafaktoren (RF: IgM, das gegen körpereigenes IgG gerichtet ist) kann die Messung verfälschen, indem es an Ag-gebundenes IgG bindet und vom anti-hIgM detektiert wird. D.h. statt IgM mißt man IgG.

richtig-positiv:                  falsch-positiv durch RF: 
 
|Ag   >-X-<    >-E    -> FR       |Ag   >-     >-X-<     >-E     -> FR

      S-IgM   anti-IgM                 S-IgG   IgM-RF   anti-hIgM

Um dieses Problem zu umgehen wurde die Anti-μ-Technik entwickelt. Hierbei werden alle IgM-Antikörper unabhängig von ihrer Spezifität auf einer mit anti-IgM beladenen Fläche gebunden. Im zweiten Schritt kann daran nun das Virusantigen (Ag) binden, das mit dem Enzym (E) gekoppelt wurde. Ist im Patientenserum IgM gegen das Virus vorhanden wird Ag-E gebunden und die Farbreaktion ist positiv.

|-<          >-X-<      Ag-E     -> FR
  
anti-IgM     S-IgM     

Virusnachweis mit ELISA

Virusantigen kann mit dem Sandwich-ELISA nachgewiesen werden. Auf der Oberfläche befinden sich gegen das Virusantigen gerichtete Antikörper. Bindet daran Virus-Antigen, das im Patientenmaterial enthalten ist, dann kann dieses mit einem zweiten, Enzym-gekoppelten Antikörper markiert werden, der allerdings gegen ein anderes Epitop des Antigens gerichtet sein sollte, um Kreuzreaktionen zu vermeiden.

|-<    Ag    >-E     -> FR
 
anti-Ag      anti-Ag

Immunfluoreszenztest (IFT, IFA)

Sowohl IgG-Antikörper als auch IgM-Antikörper können mit dem IFT nachgewiesen werden. Am häufigsten ist die Anwendung des indirekten IFT bei Infektionen mit Influenzaviren und dem Epstein-Barr-Virus.

Hinweis: Freie Viren können nicht detektiert werden, da diese beim Waschen weggespült werden.

Antikörpernachweis (indirekter IFT bzw. IIF)

Ausgangsmaterial für den IIF sind meistens mit Testviren infizierte Zellen, die auf Glasplättchen fixiert und mit dem Patientenserum inkubiert werden. Durch Spülen werden die nicht gebundenen S-Ak abgewaschen. Die Zellen werden dann mit einem anti-hIg inkubiert, das mit einem Fluorochrom (z.B. Fluoresceinisothiocyanat, FITC) gekoppelt ist. Die Immunfluoreszenz kann im Fluoreszenzmikroskop gesehen werden.

|Ag    >-       >-F
 
      S-Ig     anti-hIg

Antigennachweis (direkter IFT bzw. DIF)

Das Antigen wird im Patientenmaterial direkt mittels Fluorochrom-markiertem Ak nachgewiesen.

|Ag   >-F 
   
     anti-Ag

Hämagglutinationshemmtest (HHT)

Hämagglutinationshemmtest, SK - Serumkontrolle, ohne Vorlage von Antigen

Der HHT findet Anwendung bei Viren, deren Oberflächenproteine in der Lage sind an Erythrozyten zu binden und diese zu agglutinieren, was z.B. bei Rötelnviren der Fall ist. Die so gebundenen Erythrozyten bilden ein Netzwerk aus, das nicht mehr auf den Boden des Reaktionsgefäßes absinkt. Im HHT wird nun dem System aus Rötelhämagglutinin und Test-Erythrozyten das zu testende humane Serum zugegeben. Serum-Antikörper, die gegen das Virus gerichtet sind binden an die Öberflächenproteine der Viren und verhindern die Hämagglutination, die Erys sinken ab und bilden einen "Knopf". Zur Quantifizierung wird das zu testende Serum in Verdünnungsstufen in den Test eingebracht. Dadurch kann der Titer ermittelt werden, der gerade noch ausreicht, um die Hämagglutination zu unterbinden. In der Routinediagnostik wird dieser Test zur Bestimmung des Röteln-Titers verwendet.

R-Ag (Hämagg.)    >-   -> Hämagg.-Inakt. -> keine Agglutination, Test-Erys sinken ab ("Knopf") 
                 S-Ig
 
R-Ag (Hämagg.)                           -> Agglutination ("Netz")

Komplementbindungsreaktion (KBR)

Komplementbindungsreaktion, SK - Serumkontrolle, ohne Vorlage von Antigen

Die KBR erkennt im Wesentlichen nur IgG1-, IgG3- und IgM-Antikörper. Für die Diagnostik einer akuten Infektion sind daher 2 aufeinander folgende Serumproben (Abstand 5-10 Tage) notwendig, bei denen ein erhöhter KBR-Titer im Falle einer akuten Infektion festzustellen ist. Die KBR ist eine sehr alte Methode, die derzeit von neueren Verfahren abgelöst wird. Sie kann bei fast allen viralen Infektionen angewendet werden. Das hauptsächliche Anwendungsgebiet ist die Serologie von Influenza A/B, Parainfluenza, RSV, VZV, Masern, Mumps und Adenoviren.

Prinzip: Antikörper binden nach Antigenkontakt (am Fab-Teil) mit ihrem Fc-Teil Komplement.

Testverfahren: Das Patientenserum wird mit Testvirusantigen zusammengebracht und dann Komplement dazugegeben. Besitzt der Patient Ak gegen das Virus-Ag, so bilden sich Ag-Ak-Komplexe und der Ak bindet Komplement. Das Komplement wird dadurch weggefangen. Im zweiten Schritt werden dann Hammelerythrozyten dazugegeben, die mit Kaninchen-Antikörpern (anti-Hammel) bedeckt sind. Da kein freies Komplement da ist kommt es nicht zur Hämolyse. Ist das Patientenserum negativ, so bleiben das Ag und Komplement frei, Komplement bindet an das Kaninchen-Ig auf den Hammelerythrozyten und führt zur Hämolyse. Durch verschiedene Verdünnungen des Patientenserums kann eine Titerbestimmung erfolgen.

Virus-Ag   >-   Komplement -> kein Komplement übrig -> Ak-beladener Ery i.O. -> keine Hämolyse                        
          S-Ig
 
Virus-Ag         Komplement -> Komplement bindet an Ak auf dem Ery -> Hämolyse

Hämolyse-im-Gel-Test (HIG)

Mit Rötelnvirusantigen beschichtete Erythrozyten werden in Agarosegel gegossen. In das Gel werden kleine Löcher gestanzt und das Patientenserum zusammen mit Komplement eingefüllt. Wenn das Serum anti-Röteln-Immunglobuline enthält, so kommt es zur Hämolyse. die Größe des Hämolysehofs ist proportional zur Antikörperkonzentration im Serum.

Ery|Ag    >-      Komplement   ->  Hämolyse 
         S-Ig
  
Ery|Ag            Komplement   ->  keine Hämolyse  

Westernblot

Der Westernblot wird hauptsächlich bei der Diagnostik von HIV 1 und 2, Röteln, CMV, EBV, Hanta-Viren, HTLV und HCV eingesetzt. Er wird verwendet, um die in dem ELISA-Test erhaltenen Ergebnisse zu bestätigen oder um weitere diagnostische Fragestellungen zu bearbeiten. Er bietet die Möglichkeit Antikörper gegen mehrere virale Proteine gleichzeitig nachzuweisen.

Vorbereitung eines Teststreifens (Bsp. HIV): Eine T-Lymphozyten-Zellkultur wird mit HIV infiziert zur Erzeugung von viralen Antigenen. Die Zellen werden zentrifugiert und aus dem Lysepuffer ein Extrakt gewonnen. Die Proteine werden mittels Gel-Elektrophorese aufgetrennt und per Elektroblot auf Nitrocellulosefolie übertragen, die dann in (Test)Streifen geschnitten werden kann. Auf dem Streifen sind die Antigene dann in einer festen Reihenfolge angeordnet, die durch die Wanderungsgeschwindigkeit der Proteine im Gleichstromfeld vorgegeben ist.

Durchführung: Das Patientenserum wird auf den Teststreifen aufgetragen und beides inkubiert. Sind im Serum Antikörper vorhanden, dann können die Antigen-Antikörper-Komplexe wieder mit einem Chromogen- oder Fluorochrom-gekoppelten anti-hIg sichtbar gemacht werden. Im Bsp. sind S-Antikörper gegen Protein 1 und 3 vorhanden:

          | |                                       | |  
Protein 1 |Ag1    >-              >-E/C/F           |x| pos
          | |      S-anti-Ag1     anti-hIg          | |
Protein 2 |Ag2                                      | | neg
          | |                        "              | |
Protein 3 |Ag3    >-                                |x| pos
          | |      S-anti-Ag3        "              | |
                                        
     Teststreifen                                Teststreifen

Nukleinsäuren-Nachweis

in situ-Hybridisierung

Die in situ-Hybridisierung wird vor allem bei der Identifizierung und Typisierung von Humanen-Papilloma-Viren (HPV) angewendet.

Technik: Das Patientenmaterial wird aufgearbeitet und die angereicherte Nukleinsäure (NS) auf Nitrozellulosefolie oder Plastik fixiert. Mit spezifischen einzelsträngigen Gen-Sonden können nun bestimmte Nukleotidsequenzen in der denaturierten, einzelsträngigen DNA oder RNA aus dem Patientenmaterial nachgewiesen werden (Hybridisierung komplementärer Stränge). Die Gen-Sonden sind dafür mit Fluorochromen oder radioaktiven Isotopen markiert.

|NS    Sonde-F

Erweiterte Hybridisierung

Die Signale der in situ-Hybridisierung können verstärkt werden, in dem die Sonde nicht direkt markiert ist, sondern ein markierter anti-Sonden-Ak eingesetzt wird, der gleich mehrfach an eine Sonde binden kann.

|NS    Sonde     >-F 
               
                anti-Sonde-Ig-F                               

Polymerasekettenreaktion (PCR)

Grundprinzip der PCR.

Grundprinzip der PCR.

Da Hybridisierungsverfahren manchmal an der zu geringen Nukleinsäuremenge scheitern, kann letztere durch die Polymerasekettenreaktion vermehrt werden.

Für RNA-Viren ist vor dem Verfahren noch ein Umschreiben der RNA in DNA mit Hilfe einer Reverse Transkriptase (RT) notwendig. Die reverse Transkription und die anschließende Amplifikation des Genoms via PCR wird unter der Abkürzung RT-PCR zusammengefasst. Die PCR bzw. RT-PCR ist für fast alle humanpathogenen Viren etabliert. Eingesetzt wird sie, wenn andere Nachweisverfahren kein positives Ergebnis liefern, aber ein dringender Verdacht auf eine virale Infektion besteht, zur Bestimmung von Genomäquivalenten für prognostische Zwecke, zum Therapie-Monitoring oder falls keine anderen Methoden zur Verfügung stehen.

Technik: Der Prozess verläuft in drei Schritten, die mehrfach wiederholt werden. 1.) Aufschmelzen der Doppelstränge in Einzelstränge bei ca. 95°C, 2.) Primerhybridisierung, je nach verwendetem Primer bei 50° bis 65° 3.) Erzeugung des Komplementärstrangs: Die Polymerase lagert sich an den Primer an und verlängert den neuen Strang in 5'3'-Richtung. Von der verwendeten Polymerase und der Länge des zu amplifizierenden DNA-Stücks hängen Temperatur (68-72°C) und Dauer dieser Phase ab. Danach wird der Zyklus wiederholt. Die Durchführung von X Zyklen amplifiziert dann einen DNA-Strang zu 2^X identischen Tochtersträngen.

Weblink:  Polymerase-Kettenreaktion

Größenbestimmung amplifizierter DNA-Fragmente mittels Agarosegelelektrophorese

Die DNA-Fragmente können im Agarosegel, an das eine definierte elektrische Spannung angelegt wird nach ihrer Größe (proportional zur Wanderungsgeschwindigkeit) aufgetrennt werden.

Quellen

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