Praktikum Organische Chemie/ Trennung und Isolierung niedermolekularer organischer Verbindungen/ Trennungen durch Adsorptions-Schichtchromatographie

Trennungen durch Adsorptions-Schichtchromatographie

Diese Variante der Schichtchromatographie unterscheidet sich apparativ kaum von der Verteilungs-Schichtchromatographie. An die Stelle der stationären Phase tritt jedoch hier ein Adsorbens, über das sich die mobile Phase bewegt. Adsorptions- und Desorptions-Schritte werden so systematisch wiederholt. Dies führt dazu, dass Substanzen, die vom Adsorbens verschieden stark gebunden werden, von der mobilen Phase (Fließmittel, Laufmittel) mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten transportiert werden. In der Praxis werden auch bei der Verteilungs-Schichtchromatographie Adsorptionsmechanismen wirksam, so dass häufig Mischmechanismen vorliegen. So hat auch eine Cellulose- bzw. Papierschicht durch die Hydroxygruppen ein gewisses Adsorptionsvermögen. Konzeptionell ist es jedoch nützlich, die Prinzipien der Adsorptions- und der Verteilungschromatographie auseinanderzuhalten.

Adsorbentien

Die mit Wasser oder Lösungsmitteln zu einem Brei angerührten pulverförmigen Adsorbentien werden auf einen Träger (z. B. Glasplatte) ausgestrichen; anschließend lässt man die Schicht langsam trocknen. In Praktika sind Objektträger für die Mikroskopie beliebt, welche – sorgfältig fettfrei gemacht – durch Eintauchen in eine Suspension von Kieselgel beschichtet werden können. Für höhere Ansprüche gibt es im Handel Geräte zum Ausstreichen, Trocknen und Lagern der Platten. Die Adsorbentien haften schlecht auf dem Träger; daher werden Bindemittel zum Fixieren des Sorbens zugesetzt, z. B. Calciumsulfat (Gips). In der analytischen Praxis wird man sich die Mühe des Bereitens der Schichten nicht mehr machen wollen und greift daher auf „Fertigplatten“ bzw. „Fertigfolien“ zurück, die von verschiedenen Herstellern angeboten werden.

Das heute bevorzugte Adsorbens ist Kieselgel, welches in verschiedenen Korngrößen und Qualitäten käuflich ist. Daneben wird Aluminiumoxid verwendet, für spezielle Trennungen Magnesiumsilikat und andere Adsorbentien.

Kieselgel besteht aus polymerer Orthokieselsäure. Die Körner tragen an ihrer Oberfläche Silanol-Gruppen (Si-OH), welche dem Kieselgel einen schwach sauren Charakter verleihen und die Oberfläche zu einem H-Brücken-Donor machen. Moleküle mit H-Brücken-Akzeptoren, z. B. Amine, werden daher besonders stark adsorbiert, wandern daher langsam oder gar nicht mit der mobilen Phase; ihr R_f-Wert (Retentionsparameter) ist klein.

Bild 7-1. Schematisches Modell einer Kieselgeloberfläche

Beziehungen zwischen adsorbiertem Molekül und Adsorbens

Für die chromatographische Praxis wurden Reihenfolgen der "Adsorptionsstärke" wichtiger organischer Verbindungen, geordnet nach funktionellen Gruppen, ermittelt. Diese können für die Abschätzung der „Laufeigenschaften“ im Schichtchromatogramm nützlich sein:

• Für Kieselgel:

Gesättigte Kohlenwasserstoffe < aromatische Kohlenwasserstoffe < Alkylhalogenide < Ether < Aldehyde < Ketone ~ Ester ~ Nitrile < Alkohole < Carbonsäuren < prim. Amine < Carbonsäureamide.

• Für Aluminiumoxid:

Ähnliche Abstufung, jedoch werden Carbonsäuren stärker adsorbiert als Amine oder Carbonsäureamide! Aluminiumoxid ist basischer als Kieselgel, bindet daher H-Brücken-Donoren besonders stark.

Die mobile Phase (Fließmittel)

Nach dem Prinzip der systematisch wiederholten Adsorption/Desorption muss die mobile Phase die adsorbierten Moleküle von der Festphase verdrängen können. Die „Potenz“ eines Lösungmittels, dies zu tun, wurde als „Lösungsmittelstärke“ (engl. solvent strength) bezeichnet. In der Adsorptionschromatographie gängige Lösungsmittel wurden in der sog. Eluotropen Reihe angeordnet (Tabelle #).

Parameter der Lösungsmittelstärke (ε⁰, solvent strength) von mobilen Phasen für die Adsorptionschromatographie, nach Snyder

Lösungsmittel	Adsorbens		Polaritätsparameter
	Al2O3	SiO2	π*	β	α
n-Pentan	0,00	0,00
n-Hexan	0,01	0,03	–0,08	0,00
Petrolether	0,01
Cyclohexan	0,04	0,03	0,00	0,00
Tetrachlormethan	0,18	0,11	0,28	0,00
Toluol	0,29		0,54	0,11
Benzol a)	0,32	0,25	0,59	0,10
Diethylether	0,38	0,38	0,27	0,47
tert-Butylmethylether b)	0,3 – 0,4
Chloroform	0,40	0,26	0,58	0,00
Dichlormethan	0,42	0,32	0,82	0,00
Aceton	0,56	0,47	0,71	0,48
Dioxan	0,56	0,49	0,55	0,37
Tetrahydrofuran	0,57		0,58	0,55
Ethylacetat	0,58	0,38	0,55	0,45
Acetonitril	0,65	0,50	0,75	0,31
Pyridin	0,71		0,87	0,64
1-Propanol	0,82		0,52		0,78
Ethanol	0,88		0,54	0,77	0,83
Methanol	0,95	0,73	0,60	0,62	0,93
Wasser	sehr groß c)		1,09	0,18	1,17

a) Das potentiell cancerogene Benzol sollte in Praktika möglichst nicht verwendet werden. In den meisten Fällen kann es durch Toluol ersetzt werden. b) C. J. Little, J. Chromatogr. 169, 381 (1979); verhält sich chromatographisch sehr ähnlich wie Diethylether. c) Wasser verursacht die Desaktivierung des Sorbens und vom Sorptionsmechanismus her eine Annäherung an die Verteilungschromatographie.

Chemisch modifizierte Kieselgelschichten. Umkehrphasenchromatographie

(Reversed phase chromatography)

Die Silanolgruppen der Kieselgeloberfläche (Bild 7-1) lassen sich mit einer monofunktionellen organischen Verbindung zur Reaktion bringen, wodurch eine Bedeckung der Oberfläche mit organischen Molekülgruppen erzielt wird. Die Kieselgeloberfläche wird dadurch chemisch modifiziert. Organosiliciumverbindungen haben für die chemische Modifizierung eine besonders große Bedeutung gewonnen. Die Si-OH-Gruppen lassen sich durch Umsetzung mit Chlortrimethylsilan "blockieren". Die H-Brücken-Bindung zur Kieselgeloberfläche wird dadurch nicht mehr wirksam. Man spricht von "silanisierten" Oberflächen.

Bild 7-2. Silylierung von Kieselgel mit Chlortrimethylsilan.

Durch Reaktion mit z.B. Chlordimethyl-octylsilan läßt sich eine monomolekulare Bedeckung der Oberfläche durch chemisch gebundene längere Alkylreste erreichen. Man kann annehmen, dass sie wie die Haare einer Bürste auf der Kieselgeloberfläche stehen. Die Oberfläche wird dadurch unpolar, hydrophob.

Bild 7-3. Kieselgeloberfläche (schematisch), belegt mit Chlor-trimethylsilan (links), Chlor-dimethyl-octylsilan (Mitte) und Dichlor-dialkylsilanen (rechts).

Leider sind die so erzeugten Oberflächen nicht völlig stabil gegen Wasser. Durch Hydrolyse können die Organosilangruppen wieder abgespalten werden. Eine größere Stabilität gegenüber Hydrolyse wird durch Umsetzung mit Dichlordialkylsilanen erzielt: Mit benachbarten Si-OH-Funktionen bilden sich ringförmige Siliciumderivate. Im einfachsten Fall wird Dichlor-dimethylsilan verwendet, doch lassen sich Alkylreste mit bis zu 18 C-Atomen einbauen.

Besonders hydrolysestabile Schichten liefert die Reaktion mit Trichloralkylsilanen, die vermutlich mit drei OH-Gruppen der Kieselgeloberfläche eine Bindung eingehen.

Bild 7-4. Kieselgeloberfläche (schematisch), belegt mit Trichlor-octadecylsilan. Die Bindung des Siliciumatoms an drei Sauerstoffatome ist wegen der Übersichtlichkeit nur rechts gezeigt.

Die Stabilität gegen Hydrolyse ist wichtig, weil man an diesen chemisch-modifizierten Oberflächen mit wässrig/organischen Lösungsmittelgemischen, z.B. Acetonitril/Wasser, als mobiler Phase chromatographiert. Die mobile Phase ist also in diesem Fall polar, die stationäre Phase unpolar (Chromatographie mit umgekehrten Phasen, reversed phase chromatography).

Chemisch modifizierte Kieselgele werden von verschiedenen Firmen hergestellt. Auch „Fertigplatten“ für die Dünnschichtchromatogaphie werden geliefert. Reversed-Phase-Materialien werden mit dem Symbol RP charakterisiert, die angehängte Zahl gibt die Länge der Alkylkette an, z.B. Kieselgel RP-12 : Dodecyl-modifizierte Schicht. Beachte : RP-2 bedeutet Behandlung mit Dichlordimethylsilan, wird normalerweise nicht als Material für die Schichtchromatographie verwendet. Die Alkylreste können auch funktionalisiert sein; dadurch erzeugt man spezielle Oberflächen mit mittlerer Polarität. Eingebaut werden 3-CyanoethyIgruppen, 3-Amino- oder 3-Dimethylaminopropylreste. Die "3-Aminopropylphase" kann durch Umsetzung des Kieselgels mit 3-Aminopropyl-trimethoxysilan aufgebaut werden.

Bild 7-5. Funktionalisierte Silane zur Umkehrphasen-Chromatographie.

Techniken der Schichtchromatographie

Dünnschichtchromatograhpie

Ursprünglich war die Schichtchromatographie eine analytische Methode. Die Schichten waren dünn, ca. 0.2 mm, daher die Bezeichnung „Dünnschichtchromatographie“("DC"), engl. TLC (thin layer chromatography).

Wie in Kapitel 5 beschrieben, wird die Analysensubstanz punktförmig oder als kurzer Strich an der Startlinie aufgetragen. Man lässt in der Trennkammer das Fließmittel „laufen“ und ermittelt die R_f-Werte. Diese am meisten angewandte Technik wird auch als "eindimensionale Entwicklung“ bezeichnet.

Bild 7-6. Eindimensionale Entwicklung eines Dünnschichtchromatogramms.

Präparative Schichtchromatographie (PSC, "Dickschichtchromatographie")

Bei dieser erst später eingeführten Technik arbeitet man mit Schichten von ca. 2 mm, die auf quadratischen oder rechteckigen Glasplatten aufgebracht sind. Man kann die Schichten selbst herstellen, aber es erfordert Übung, diese gleichmäßig und nach dem Trocknen frei von Rissen zu erhalten. Einfacher ist es, sogenannte Fertigplatten zu kaufen.

Das mit einem leicht verdampfbaren Lösungsmittel verdünnte, zu trennende Gemisch wird horizontal als langer Strich in einigem Abstand zur Kante der Platte aufgetragen (Bild 7-3a). Nach Verdunsten des Lösungsmittels lässt man in einem Chromatographietrog mit dem Fließmittel entwickeln. Welches dafür geeignet ist, findet man vorher durch dünnschichtchromatographische Tests heraus.

Die (eindimensionale) Entwicklung wird in der Regel mehrfach durchgeführt; jedesmal muss aber das Fließmittel durch Verdunsten entfernt worden sein. Die getrennten Substanzen erscheinen in bandförmigen Zonen (Bild 7-3b). Nach ihrer Lokalisierung (s.u.) werden diese mit einem Bleistift markiert und herausgeschabt. Anschließend wird die adsorbierte Substanz mit einem geeigneten (polaren) Lösungsmittel vom Kieselgel abgelöst (extrahiert).

Bild 7-7. Präparative Schichtchromatographie auf einer quadratischen Platte (20 × 20 cm), schematisch. 3a (links): Die zu trennende Substanzmischung wurde strichförmig aufgetragen (dunkle Linie). 3b (rechts): Nach der aufsteigenden Entwicklung in der Trennkammer sind die Komponenten in Zonen aufgetrennt worden. Die Front der mobilen Phase wurde markiert.

Die Methode hat den Vorteil, dass die Ergebnisse der (analytischen) Dünnschichtchromatographie leicht auf die präparative Schichtchromatographie übertragen werden können, wenn auch die Trennleistung (Performance) nicht an die der DC heranreicht. Jedoch können so relativ einfach Substanzen gewonnen werden, deren Menge für eine spektroskopische Strukturaufklärung ausreicht. Mit ca. 20 mg Substanz aus der PSC können routinemäßig NMR-, IR-, UV- und Massenspektren erhalten werden.

Es besteht auch die Möglichkeit, mehrere Dickschichtplatten gemeinsam in einem Gestell in einer größeren Trennkammer zu entwickeln. So kann man die Substanzmenge erhöhen.

In Konkurrenz zur PSC treten jedoch die Methoden der präparativen Säulenchromatographie (Kapitel 8).

Detektion und Nachweis der Substanzen in der Dünnschichtchromatographie

Allgemeine Methoden

Unmittelbar zu erkennen und zu lokalisieren sind die Flecke von farbigen Substanzen (vgl. 2,4-Dinitrophenylhydrazone). Substanzen mit Eigenfluoreszenz (z.B. Anthracen) können durch Betrachten der Schicht im UV-Licht erkannt werden.

Häufig wird in die Schicht der Adsorbentien (Kieselgel) noch ein Leuchtstoff (Fluoreszenzindikator) eingearbeitet. Dadurch leuchtet die Schicht, wenn man sie unter eine UV-Leuchte hält. Je nach dem Strahlungsmaximum der handelsüblichen UV-Leuchten bei 254 nm und 360 nm werden die Sorbentien mit dem Zusatz F₂₅₄ bzw. F₃₆₀ charakterisiert, z.B. Kieselgel GF₂₅₄ (G steht für das Bindemittel Gips, F für Fluoreszenzindikator).

Flecke auf der Schicht, deren Substanz selbst UV-Licht absorbiert, z. B. Benzolderivate oder konjugierte π-Elektronensysteme, können die Fluoreszenz an ihrem Ort löschen. Auf der hellblau fluoreszierenden Schicht erscheinen daher die Flecke dunkel.

Reagentien zur Detektion in der Schichtchromatographie

Substanzflecke, die nach den oben genannten Methoden nicht detektiert werden können, müssen durch Reagentien sichtbar gemacht werden. Zahlreiche Reagentien wurden dafür entwickelt; meistens werden diese auf die Schicht gesprüht. In manchen Fällen kann man die Platte bzw. Folie auch in eine Lösung des Reagens eintauchen, doch löst sich dabei manchmal die Schicht vom Träger ab.

Universalreagenzien

In vielen Fällen weiß der Analytiker zunächst nicht, zu welchen Verbindungsklassen die getrennten Substanzen gehören. Hier sind Reagentien gefragt, durch welche die Flecke in möglichst jedem Fall lokalisiert werden können. Diese Reagenzien sind „brutal“ und zerstören die Substanz durch Verkohlung oder Oxidation. Häufig erwärmt man die Schicht zur Beschleunigung des Prozesses im heißen Luftstrom (Gebläse, "Fön").

• Konzentrierte Schwefelsäure kann aufgesprüht zur Braun- oder Schwarzfärbung der Flecke führen.
• Chromschwefelsäure kann viele Substanzen oxidieren und wird dabei reduziert. Die resultierenden Chrom(II)-Salze bilden einen farblosen bis schwach grünen Fleck auf der durch überschüssiges Chromat gelb gefärbten Schicht.

• Kaliumpermanganat-Schwefelsäure ist ein sehr starkes Oxidationsmittel. Die nach Aufsprühen rosafarbene Schicht zeigt an den Stellen farblose Flecke, wo Reduktion zu Mangan(II)-Salzen eingetreten ist.
• Eine Lösung von Kaliumpermanganat in Wasser, neutral oder alkalisch, evtl. mit Silbernitrat ist angenehmer zu handhaben. In diesem Fall wird die Permanganat-Ionen nur zum Mn⁴⁺ (Braunstein) reduziert, so dass auf rosa Hintergrund braune Flecken sichtbar werden.

Generell ist jedoch der Nachweis mittels dieser Universalreagenzien nicht sehr empfindlich.

Fluoreszenzerzeugende Anfärbereagenzien

Manche Substanzen bilden Assoziate mit organischen Farbstoffen und lassen sich daher anfärben. Besonders geeignet sind dafür im sichtbaren oder ultravioletten Licht fluoreszierende Farbstoffe, wie 2',7'-Dichlorfluorescein, Rhodamin B, Rhodamin G, Ammoniumsalz der 8-Anilinonaphthalin-1-sulfonsäure (ANS-Reagens) und 6-(4-Toluidino)-naphthalin-2-sulfonsäure (TNS-Reagens). Diese Nachweise sind schon bei sehr geringen Substanzmengen wirksam, was in der analytischen Chemie für alle Fluoreszenz-Methoden gilt.

Oxidierende Reagenzien

Neben den oben genannten oxidierenden Reagenzien werden auch schwächere Oxidationsmittel benutzt, die daher nicht "universal" wirksam sein können. Aber in einigen Fällen sind sie sehr nützlich und liefern beim Redoxvorgang prächtige Farben, u.a.

• Eisen(III)chlorid - Kaliumhexacyanoferrat(III): Eisen(III) wird zu Eisen(II) reduziert und ergibt dann „Berliner Blau“ am Ort des Flecks.
• Phosphormolybdänsäure (Molybdatophosphorsäure)
• Cer(IV)ammoniumnitrat in verd. Salpetersäure

Gruppenspezifische Reagenzien

• Nachweis von Carbonsäuren: pH-Indikatoren wie Bromkresolgrün, Bromphenolblau.

• Nachweis von Carbonsäureestern: Hydroxylamin - Eisen(III)chlorid-Reagens (Hydroxamsäuretest).

• Nachweis von Aldehyden und Ketonen: 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Reagens

• Nachweis von primären Aminen und Aminosäuren: Ninhydrin-Reagens

Spezialreagenzien

In diese Klasse lassen sich zahlreiche Reagenzien einordnen, die für verschiedene Verbindungsklassen mehr oder weniger spezifisch sind. Häufig verwendet werden Lösungen aromatischer Aldehyde in starken Säuren, welche - aufgesprüht - starke, bunte Färbungen der Flecke erzeugen können (Aldehyd - Säure – Reagenzien). Hierunter fallen:

• p-Methoxybenzaldehyd (= Anisaldehyd)–Schwefelsäure-Reagens
• Vanillin-Schwefelsäure-Reagens
• p-Dimethylaminobenzaldehyd-Salzsäure-Reagens (Ehrlichs Reagens)
• Diazotierte Sulfanilsäure

Eine weitere, einfach anzuwendende Detektionsmethode sind Dämpfe von Reagenzien, denen die Schicht in einer abgeschlossenen Chromatographie-Kammer ausgesetzt wird.

• Iod – Dampf kann gelblich/bräunliche Komplexe mit manchen organischen Verbindungen liefern oder sich an C=C-Doppelbindungen addieren (Nachweis in einer „Iod-Kammer“).

Literatur

Als Einführung in die theoretischen Grundlagen und für die praktische Arbeit können folgende kurze Lehrbücher dienen:

• G. Schwedt, Chromatographische Trennmethoden, 2. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1986.
• R. J. Gritter, J. M. Bobbitt und A. E. Schwarting, Einführung in die Chromatographie, Springer Verlag, Berlin - Heidelberg, 1987.

Ausführliche Informationen über die Dünnschichtchromatographie findet man in folgenden Monographien:

• E. Stahl (Hrsg.), Dünnschichtchromatographie, 2.Aufl., Springer Verlag, Berlin, 1967.
• G. Hesse, Chromatographisches Praktikum, 2. Aufl. Akademische Verlagsgesellschaft, Frankfurt/Main, 1968.
• K. Randerath, Dünnschichtchromatographie, 2.Aufl., 2. Nachdruck, Verlag Chemie, Weinheim, 1975.
• J. C. Touchstone und M. Dobbins, Practice of Thin Layer Chromatography, John Wiley & Sons, New York, 1978.
• H. Wagner, S. Bladt und E. M. Zgainski, Drogenanalyse. Dünnschichtchromatographische Analyse von Arzneidrogen, Springer Verlag, Berlin, 1983.

Versuche

• Isolierung von Myristicin aus dem Muskatnuss-Extrakt durch präparative Schichtchromatographie (PSC)